三维预血管化微民间组织中成纤维细胞促进内皮细胞出芽及迁移的研究

落或多肽上所菱转变成的基本。二维五小基本在甲锥状腺解构调控有助于研究工作之前不具最重要作用，但难以各种类型体盐酸繁复纤锥状况及用以框架复刻的先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织[9]。平面投影五小基本是指将两种及以上的线粒体总共同培育出于平面投影基本之前，这样一来减小肾脏与体盐酸锥状况的关联性。现阶段，肾脏框架先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织之外研究工作之前，选用的平面投影五小基本包括反之亦然将ECs 和HFs喂养于基质胶之前的五小假设号，或在两层基质胶之前喂养ECs 的“三明治”假设号[10]，或将ECs 和周线粒体五小于肠胃混和物内的腔体通道之前[11]，但将这些培育出秘密第一组织进讫复刻修补时，操作方法长期存在一定难度。有研究工作将ECs喂养于纤多肽上并包埋于混和物之前，但多为单一线粒体培育出，值得一提的是五小研究工作之外美联社[12]。本次研究工作将HFs和HUVECs五小于多下端纤多肽上，框架平面投影先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织，并将其包埋于纤维受体混和物之前，探寻在平面投影培育出锥状况之前HUVECs 的出芽反复及HFs对HUVECs迁至的 作出贡献作用，为规模解构高纯度先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织奠定基本。

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临 吊 资 料

1.1 测试线粒体及主要试剂、仪器

婴儿包皮是从HFs由本测试室分离并复原[13]。HUVECs 欧美制造汉口复蒙基因海洋生物新技术有限新公司。

Cytopore 2纤多肽（GE 新公司，英美两国）；DMEM菌落（GIBCO新公司，英美两国）；FBS（HyClone新公司，英美两国）；头孢菌素、瓦克斯曼（汉口碧云天海洋生物新技术有限新公司）；在手晶紫、PKH26（Sigma新公司，英美两国）；纤维受体原、凝血酶、抑肽酶（汉口索莱宝海洋生物科技有限新公司）；橙色电子显微镜受体太快感染（pLenti-green fluorescent protein，pLenti-GFP）、紫色电子显微镜受体太快感染（pLenti-red fluorescent protein，pLenti-RFP）由之前国苏联科学院汉口人类苏联科学院惠利健教授提供。

烘烤转酒瓶（Coring新公司，英美两国）；电子显微镜显纤镜、高功率总共揭示显纤镜（Nikon新公司，欧美）；超净木条、CO2 培育出箱（Thermo Fisher Scientific新公司，英美两国）；离心机（Beckman Coulter新公司，英美两国）； Image J平面图形处理的软件（英美两国国立卫生研究工作院）。

1.2 线粒体培育出

HUVECs和HFs以外选用计有10%FBS、100 U/mL头孢菌素和100 μg/mL瓦克斯曼的DMEM菌落，放在37℃、5%CO2 及饱和湿度培育出箱之前培育出，待发育至90%从右方右方融合度时讫线粒体传代。得用第3～5 代线粒体备用。

1.3 二维五小基本框架及精确测量

1.3.1 PKH26颜料HFs 以胰受体酶消解构，菱转变成单线粒体悬盐酸；以离心重力加速度15 cm，1 500 r/min 离心5 min；无人体内菌落浴1 次，吸去上清，转为PKH26 颜料盐酸，吹匀线粒体并放在培育出箱幼鸟3～5 min；转为一定量FBS幸而止颜料底物1 min；转为一定量计有10%FBS的DMEM 菌落稀释之前止底物盐酸；以离心重力加速度15 cm，1 500 r/min 离心10 min； 浴涤重悬线粒体并总和，用以二维五小。

1.3.2 二维五小及精确测量① 得用PKH26颜料的HFs，变更并固定线粒体通量为5.0×104个/mL，在此基本上按照HFs∶HUVECs为1∶4、1∶1、4∶1%得用相应比例HUVECs。② 根据有所不同喂养作法，测试分为HF-EC第一组及HFMaxEC第一组。HF-EC第一组：顺序排列喂养2种线粒体，即首先将HFs喂养于24下端刷（每下端1 mL），于37℃、5%CO2及饱和湿度培育出箱之前选用DMEM菌落培育出48 h 后，再次按照上述%分别喂养HUVECs。HFMaxEC第一组：得用HFs 及HUVECs按照上述%反之亦然混和喂养于24 下端刷培育出。每第一组单调3下端。③ 选用电子显微镜显纤镜自培育出开始不间断10 d掩蔽各第一组线粒体菱结构上，PKH26颜料的HFs 深褐色紫色，分析有所不同线粒体%及HFs 先于培育出对甲锥状腺因特网菱形 成的负面影响。

1.4 平面投影五小基本框架及精确测量

1.4.1 太快感染转染线粒体

分别得用3.0×105个HUVECs和HFs，喂养于椭圆形6 cm的平皿之前，于37℃、5%CO2 及饱和湿度培育出箱之前选用DMEM菌落培育出24 h 后，分别转为200 μL pLenti-GFP （HUVECs）或pLenti-RFP（HFs），以及菌落总重量1/1 000的Polybrene氢氧解构钠。24 h 后非常换新鲜菌落并之前培育出，直至电子显微镜显纤镜下掩蔽线粒体表达出来橙色或紫色电子显微镜。

1.4.2 纤秘密第一组织高纯度及精确测量

① 纤秘密第一组织高纯度作法：于烘烤转酒瓶之前转为酸度为2.0 mg/mL的Cytopore 2纤多肽，灭菌处理后于DMEM 菌落之前幼鸟旅店；得用1.4.1之前经太快感染转染的线粒体（2.0×105 个/mL）喂养至酒瓶之前，每酒瓶50 mL；转为DMEM 菌落，以转速60 r/min培育出48 h 后拿到纤秘密第一组织（平面图1a）。

测试总共高纯度4 种纤秘密第一组织，其之前HF纤秘密第一组织为纤多肽以外喂养HFs， HUVEC纤秘密第一组织为以外喂养HUVECs；HFMaxEC纤秘密第一组织为反之亦然混和喂养两种线粒体；HF-EC纤秘密第一组织为先喂养HFs并培育出48 h 后，再次喂养HUVECs之前培育出48 h。

② 精确测量指标：选用低渗在手晶紫阴性菌对纤秘密第一组织之前线粒体进讫总和。具体作法：自喂养后每隔2 d得用1 mL HUVEC纤秘密第一组织或HF纤秘密第一组织，不间断14 d；将纤秘密第一组织放在EP管之前，PBS漂浴后转为0.1% 在手晶紫颜料盐酸，维持幸而重量为1 mL，37℃振荡5 h，用细菌性总和刷总和线粒体核，推算线粒体通量，表示纤秘密第一组织 上线粒体发育再次生原因。

1.4.3 平面投影五小基本框架

首先得用24下端刷，每下端转为0.5 U/mL凝血酶和0.15 U/mL抑肽酶各5 μL，混匀后转为用DMEM培育出盐酸配置的5.0 mg/mL纤维受体原氢氧解构钠200 μL，待其凝固，高纯度成铺有纤维受体混和物的下端刷。然后，每下端再次次掺入纤维受体氢氧解构钠200 μL，分别转为1.4.2 之前高纯度的4种纤秘密第一组织，每第一组单调3下端；快速转为凝血酶5 μL，放在37℃培育出箱之前凝固30 min，框架纤秘密第一组织包埋于纤维受体混和物的平面投影五小基本。幸而于，每下端掺入DMEM菌落，放在37℃、5%CO2 及饱和湿度培育出箱之前培育出（平面图1b）。

平面图 1 纤秘密第一组织高纯度及平面投影五小基本框架流程平面图a. 纤秘密第一组织高纯度；b. 平面投影五小基本

1.4.4 平面投影五小后精确测量

培育出1、3 d，高功率总共揭示显纤镜掩蔽HF纤秘密第一组织和HUVEC纤秘密第一组织之前线粒体发育及贴附原因。培育出3 d，高功率总共揭示显纤镜掩蔽4种纤秘密第一组织出芽及HF-EC纤秘密第一组织、HFMaxEC纤秘密第一组织芽体线粒体第一组成，选用Image J平面图形处理的软件推算 HF-EC纤秘密第一组织、HFMaxEC纤秘密第一组织出芽比例及芽体弧度。

1.5 HFs排泄的线粒体因子对HUVEC纤秘密第一组织出芽的负面影响

得用1.4.1 之前上面紫色电子显微镜的HFs喂养于T150酒瓶之前，于37℃、5%CO2 及饱和湿度培育出箱之前选用DMEM菌落培育出，待发育至约90% 融合度后，非常换为无人体内DMEM菌落之前培育出48 h；得用培育出盐酸，掺入10%FBS、100 U/mL头孢菌素和100 μg/mL瓦克斯曼，配制成HFs先决条件菌落。

得用1.4.2 之前高纯度的HUVEC纤秘密第一组织放在24下端刷，分别选用HFs先决条件菌落（测试第一组）或计有10%FBS、100 U/mL头孢菌素和100 μg/mL瓦克斯曼的DMEM菌落（折衷第一组）培育出，每第一组单调3下端。培育出1、3、5 d，高功率总共揭示显纤镜下掩蔽HUVEC纤 秘密第一组织出芽原因。

1.6 数学方法作法

选用Excel的软件分析。计量参考资料讫正态性检验，具备正态分布时，平面图表以以外数±期望值表示， 第一组间比较选用独立所发本t检验；检验水准α=0.05。

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在手 果

2.1 二维五小精确测量

电子显微镜显纤镜下掩蔽示，线粒体%为1∶4时， HFMaxEC第一组线粒体聚团，未能菱转变成甲锥状腺所发内部在手构；而HF-EC第一组菱转变成了明显且比较稳定的甲锥状腺所发内部在手构。%为1∶1 时，HFMaxEC第一组以外在 2 d 时直至浮现了甲锥状腺所发内部在手构，之后快速退解构成线粒体簇；而HF-EC第一组培育出2 d时即菱转变成甲锥状腺所发内部在手构，直至10 d 时仍能见部分甲锥状腺所发内部在手构。%为4∶1 时，HFMaxEC第一组可菱转变成比较比较稳定的甲锥状腺所发内部在手构，培育出至6 d时才能掩蔽到网锥状内部在手构菱转变成；而HF-EC第一组培育出至10 d时仍无网 锥状内部在手构菱转变成。见平面图2。

平面图 2 电子显微镜显纤镜掩蔽线粒体喂养%及HFs先于培育出对甲锥状腺因特网菱转变成的负面影响（×40）从上至下则有培育出2、6、10 d；从从右方至右方则有HFMaxEC第一组及HF-EC第一组 a. 1∶4；b. 1∶1；c. 4∶1

2.2 纤秘密第一组织之前线粒体发育掩蔽

低渗在手晶紫阴性菌检验示，HUVECs 和HFs以外能在2 d内完全贴附于纤多肽。0～4 d为线粒体发育延滞期，再次生缓太快；4 d后进入对数发育期，线粒体快速再次生。培育出至14 d时，HUVECs 和HFs通量则有17.6×105 个/mL和11.7×105 个/mL，与喂养时 相比分别扩增了9倍和6 倍。见平面图3。

平面图 3 纤秘密第一组织之前线粒体发育切线 a. HUVEC纤秘密第一组织；b. HF 纤秘密第一组织

2.3 平面投影五小对纤秘密第一组织出芽的负面影响

2.3.1 纤秘密第一组织之前线粒体发育贴附掩蔽高功率总共揭示显纤镜下见，HUVEC纤秘密第一组织和HF纤秘密第一组织包埋后1 d线粒体即以外匀贴附于纤多肽上；培育出至3 d时， HUVEC纤秘密第一组织上的线粒体仍紧密贴附于纤多肽上，而HF纤秘密第一组织之前的线粒体迁往纤多肽，深褐色现出芽现 头。见平面图4。

平面图 4 高功率总共揭示显纤镜掩蔽纤秘密第一组织之前线粒体发育（×100）从从右方至右方则有HUVEC纤秘密第一组织、HF纤秘密第一组织 a. 培育出1 d；b.培育出3 d

2.3.2 出芽原因掩蔽

培育出3 d 时，除HUVEC纤秘密第一组织没有出芽外，其余3 种纤秘密第一组织以外有出芽震荡，这些芽从纤秘密第一组织之前下垂，深褐色树枝锥状向上且连在一起。其之前，HF纤秘密第一组织出芽较少，芽体较短。而HF-EC纤秘密第一组织和HFMaxEC纤秘密第一组织出芽较多，芽体较长，出芽超高速几乎明确；芽体轴部（纤秘密第一组织肌腱）和之前部以外由HUVECs 和HFs总共同菱转变成，但芽体顶部（纤秘密第一组织远端）只有HFs，且HFs将要菱转变成芽的连在一起；HF-EC纤秘密第一组织芽体之前部HUVECs比HFMaxEC纤秘密第一组织非常多。见平面图5、6。

平面图 5 高功率总共揭示显纤镜掩蔽平面投影五小对纤秘密第一组织出芽的负面影响从从右方至右方则有HF 纤秘密第一组织、HUVEC 纤秘密第一组织、HF-EC 纤秘密第一组织、HFMaxEC 纤秘密第一组织 a. 明场平面图（×40）；b. 电子显微镜平面图（×100）

平面图 6 高功率总共揭示显纤镜掩蔽HF-EC纤秘密第一组织及HFMaxEC纤秘密第一组织芽体线粒体第一组成 从上至下则有HF-EC纤秘密第一组织、HFMaxEC纤秘密第一组织 a. 芽体（×200）；b～d. 芽体轴部、之前部及顶部（×500）

HF-EC纤秘密第一组织出芽比例及芽体弧度则有（24.2±2.6）个、（405.1±100.8）μm，以外高于HFMaxEC第一组的（15.8±1.7）个、（349.8±106.5）μm，关联性以外有统 计学计有意（t=5.852，P=0.001；t=2.120，P=0.039）。

2.4 HFs排泄的线粒体因子对HUVECs出芽的负面影响

高功率总共揭示显纤镜掩蔽示，折衷第一组HUVECs未出芽，5 d时HUVECs迁往纤秘密第一组织，在纤秘密第一组织周围菱转变成线粒体圈。测试第一组HUVEC纤秘密第一组织在3 d时即 有出芽，至5 d时出芽非常明显。见平面图7。

平面图 7 HFs排泄的线粒体因子对HUVEC纤秘密第一组织出芽的负面影响 （高功率总共揭示显纤镜×100）从上至下则有培育出1、3、5 d；从从右方至右方则有明场平面图及电子显微镜平面图 a. 折衷第一组；b. 测试第一组

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讨 论

传质受限制是工程解构骨秘密第一组织肾脏框架和体盐酸复刻面临的酒瓶颈情况之一，通过纤秘密第一组织工程新技术能适当补救肾脏框架物之前的传质受限制，而工程解构骨秘密第一组织的先于甲锥状腺解构可进一步大幅提高植入体盐酸后复刻物的活性，最大限度骨秘密第一组织病变修补。然而，在成骨可借锥状况之前MSCs和ECs五小虽可作出贡献MSCs成骨分解构，却不利于ECs甲锥状腺因特网菱转变成，因此必需分别框架骨纤秘密第一组织和先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织，再次进讫秘密第一组织修补。

为了框架先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织，研究工原作者尝试了多种培育出基本，如将ECs包埋于纤维受体混和物或其他材料第一组成的混和物之前[14]，但混和物之前线粒体通量有限，且难以实现规模解构高纯度。也有研究工作将线粒体单独培育出于温敏聚合物上菱转变成线粒体层，再次将菱转变成的线粒体层管壁片通过柱身沉降的作法框架平面投影秘密第一组织；但该作法因之前心传质受限制情况，框架的秘密第一组织尺寸受限[15]。亦有研究工原作者选用由壳聚糖-聚赖氨酸-海藻硫化物多层管壁包封扭矩线粒体的聚己酮类纤粒[16]，该纤囊内部在手构上深褐色盐酸态，可以补救内部在手构上传质受限制的情况。但该框架作法繁复，且缺乏一定基质抗腐蚀，而基质抗腐蚀对肾脏甲锥状腺解构也不具一定作用。本研究工作选用线粒体五小于多下端纤多肽的作法，线粒体通量高且不具基质侧向，兼具规模解构高纯度的潜力。通过引入转酒瓶建模培育出新技术，必须适当补救传质受限制的情况，同时给予线粒体一定的机械激发。有研究工作表明在海洋生物底物器的建模培育出锥状况之前，机械激发必须适当作出贡献ECs肾脏先于甲锥状腺解构[17-19]。

肾脏框架先于甲锥状腺解构秘密第一组织模组时，除了必需ECs 之外，全力支持线粒体的长期存在也同所发最重要。成纤维线粒体作为是从广泛的全力支持线粒体之一，通过排泄基质金属在受体酶过氧解构物线粒肾脏基质，作出贡献ECs迁至；排泄的线粒体因子和线粒肾脏基质，如bFGF、VEGF以及Ⅰ、 Ⅵ型号肝细胞等，有利于ECs再次生、迁至和新生甲锥状腺的比较稳定。因此，本研究工作之前选用HFs 与HUVECs 五小，取得成功框架了不具甲锥状腺解构控制能力的纤秘密第一组织。亦有研究工作美联社了MSCs对ECs甲锥状腺解构的作出贡献作用[20]，且MSCs兼具非常高的分解构控制能力，为同种除去复刻提供了有利先决条件。因此，期望可以组织起来选用MSCs进讫先于甲锥状腺解构模组框架的研究工作。

关于HFs 引导HUVECs迁至的调控有助于，现阶段尚未确切。Costa-Almeida等[8]写到在大甲锥状腺菱转变成之前，成纤维线粒体通过沉积线粒肾脏基质全力支持ECs迁至，也通过排泄线粒体因子作出贡献甲锥状腺发生。在排泄的线粒体因子之前，VEGF深得关切，其与ECs抑制成为尖端线粒体以及引导尖端线粒体定向迁至有关[21-23]。线粒肾脏基质成分比较繁复，其之前纤连受体与毛钝甲锥状腺发生有关[24]，Ⅰ型号肝细胞和Ⅵ型号肠胃与ECs出芽的数目和弧度有关[25]，Ⅷ型号肠胃还被认为必须作出贡献ECs 迁至[26]。本研究工作之前HF-EC纤秘密第一组织出芽数目多于HFMaxEC纤秘密第一组织，可能是由于HFs先于喂养的HF-EC纤秘密第一组织之前沉积了非常多的线粒肾脏基质，从而作出贡献HUVECs出芽。因此，现阶段需进一步研究工作HFs排泄物的成分第一组成，探寻关键第一组分对HUVECs出芽的负面影响及之外调控有助于，以作出贡献先于甲锥状腺解构纤秘密第一组织的甲锥状腺菱转变成。

综上述，本研究工作选用多下端纤多肽通过HFs先于培育出并以1∶1 %喂养HUVECs，在转酒瓶之前取得成功框架了兼具先于甲锥状腺解构控制能力的五小纤秘密第一组织，并现阶段证明在该纤秘密第一组织之前HFs必须作出贡献和引导HUVECs出芽。现阶段必需进一步组织起来甲锥状腺生成肾脏、体盐酸分析检验工作，如在手合平面投影分析新技术，对菱转变成的甲锥状腺所发内部在手构进讫半定量表征；定量检验HUVECs甲锥状腺生成标志物的表达出来；基于鸡胚小叶尿囊管壁甲锥状腺生成假设号以及其他动物假设号（包括秘密第一组织病变假设号）进讫动物测试，为二维和平面投影线粒体五小对甲锥状腺生成负面影响及之外有助于的探究、秘密第一组织病变修补的应用提供非常多平面图表全力支持。

参考文献：略

本文封面平面投影是从于因特网，侵删

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